胶原蛋白技术工艺发展趋势分析

第一节 产品技术发展现状

一、医用胶原蛋白技术发展状况

胶原蛋白的结构与性能表明它是一类优良的可用于引导组织再生的生物材料，已经广泛地应用于医学领域中。

1、天然真皮替代物

主要有2种类型：一种是除去表皮层的异体真皮；一种是无细胞真皮。无细胞真皮可以是异体皮，也可以是人皮。关于无细胞异体真皮及无细胞真皮的应用，国内外均有报道，可用于治疗深度烧伤创面。而无细胞人体真皮的来源十分有限，特别是存在传播恶性疾病的危险（尤其是艾滋病）。由于上述原因，在很大程度上，天然真皮替代物的应用受到限制。

2、人工皮肤

过去国内外基于皮胶原蛋白的组织工程材料主要是明胶、胶原蛋白凝胶及其与天然生物材料、高分子化合物的混合物。迄今为止，已有的人工皮肤或医用胶原蛋白膜的应用范围极为有限，所有的人工皮肤都不能全面地满足医疗手术的要求。究其原因，主要是存在以下不足：（1）作为皮肤的替代物，由于不能重建毛囊、汗腺、脂腺等皮肤附件，从而在相当程度上降低了患者对环境的适应能力；（2）血管化较慢；（3）抗感染能力差；（4）力学性能差，在含水条件下难以塑形，不利于人体内部器官的重建；（5）体外及新生组织细胞产生的胶原蛋白酶极易将其降解。材料在体内降解吸收过快，使得材料不能与体内的组织细胞生长、增殖的速度相匹配等等。

针对上述问题，研究者们主要采取了三个方面的措施：第一，通过对人工皮肤或医用胶原蛋白膜的改性来提高其力学性能；改性的方法主要是物理方法交联（如热交联、UV和γ射线交联等）、化学方法交联（如使用甲醛、戊二醛进行交联）、接枝改性（如使用RGD肽）及低温等离子改性等等；第二，多种材料复合，提高其综合性能；第三，使用生长因子。研究人员通过利用促进血管形成的生长因子包裹支持组织的多聚物载体而成功地促进了在实验室里生长的生物人工组织的血管发生。

3、可注射性胶原蛋白

主要用于整形美容，是纠正皮肤凹陷型缺陷的最理想材料，其主要适应证为皱纹、寻常痤疮疤痕、小型外伤疤痕等缺陷的填充矫正。此外，对糖尿病患者在其病变部位注射胶原蛋白有助于足部溃疡和褥疮的修复。应用较为广泛的胶原蛋白植入物是可注射性胶原蛋白溶液，主要用于矫治由于年老、创伤、疾病和先天性畸形所引起的外形异常等。

4、可降解胶原蛋白缝线

由于胶原蛋白植入物在人体内会降解为氨基酸而被人体吸收，因而利用胶原蛋白制成的胶原蛋白缝线用于特殊的医疗手术具有重要意义。临床应用表明，可吸收的胶原蛋白缝线用于眼科的角膜手术中，很少有不良反应。此外，还有关于在动物实验中利用经过纯化的胶原蛋白膜（厚度0.0013mm）作角膜移植并用液状胶原蛋白替代晶状体的报道。

5、止血海绵

研究表明，胶原蛋白不仅能够诱导血小板附着，产生释放反应，而且能够激活血液的凝固因子，粘接在渗血的伤口上，对已经损伤的血管起填塞作用，从而达到止血的目的。临床应用表明，与藻酸钙、藻酸海绵、凝血增强纤维泡沫、增凝明胶海绵及氧化纤维素等常用的止血剂相比，胶原蛋白的止血率高，副作用小，因而是一种理想的止血材料。

利用胶原蛋白研制胶原蛋白止血海绵，国外一直十分活跃，国内目前尚处于起步阶段，但发展还是很迅速的。

据报道，国外已经有粉状及片剂的微晶胶原蛋白止血剂、纤维织物止血剂和海绵止血剂等。一种取自牛跟腱的无过敏性、无菌异种冻干胶原蛋白已广泛应用于临床，并取得良好效果。国内也有类似产品问世。

6、组织引导材料

目前国内已有医用组织引导再生胶原蛋白膜产品面市。临床应用表明：此种医用胶原蛋白膜具有特有的网状结构，可参与组织愈合过程并能引导、促进细胞生长；具有显著引导/诱导组织再生的作用，使创面实现功能性、再生性的愈合；物理机械性能优异，手术操作简便，生物相容性好，无抗原性，不引起三致反应，可降解、吸收，不需二次手术取出；可广泛应用于软、硬组织损伤的修复，如口腔科、骨科、整形外科、五官科、神经外科及肌腱断裂和脏器穿孔等的治疗。

与此材料匹配的是膜引导组织再生技术（GTR技术）。GTR通过引导膜机械地阻碍非目的细胞（如表皮细胞）进入组织修复区，可使目的细胞（如骨细胞）在修复区浓集，以达到组织定向修复的目的。GTR技术最早应用于四肢长骨，20世纪80年代初，逐渐应用于口腔科。GTR引导膜主要有2种：一种是非生物降解膜，如聚四氯乙烯膜；一种是可生物降解膜，主要有胶原蛋白膜和冻干硬脑膜等。由于非生物降解膜较坚硬，易造成软组织裂隙、膜暴露、细菌感染等，且需要实施二次手术除去，故在临床中已倾向于采用可生物降解的GTR引导膜。

7、用于骨组织工程中的“Ⅰ型胶原蛋白X”植入材料

Ⅰ型胶原蛋白是骨骼中的主要结构蛋白，约占有机基质的90!。胶原蛋白在骨组织工程中可以有3种作用：①作为支架材料，可为骨细胞的长入提供支架，促进新骨生成；②利用胶原蛋白的止血性能；③具有覆盖陶瓷或金属植入物的功能。目前，国内外一般利用胶原蛋白与羟基磷灰石结合制成复合材料，植入人体，以修复骨缺损。例如，瑞典开发出一种Colipat植入物，它就是由从猪皮中提取的胶原蛋白与纯度为90!的羟基磷灰石以5:1的比例混合制成。据报道，该材料已用于临床实验，结果证明无炎症反应，且具有良好的生物相容性。由Zimmer等公司开发出的作为植骨替代物的生物材料被称为Collagraft，其中含有从牛真皮胶原蛋白中提取的纯化胶原蛋白纤维丝和羟基磷灰石/三磷酸钙陶瓷，可将Collagraft与自体骨髓相混合，自体骨髓能提供成骨前体细胞。临床应用表明，大多数患者对胶原蛋白未发生免疫反应。即使有些患者产生牛胶原蛋白抗体，对植入物的疗效和安全性也均无影响。

二、医用胶原蛋白发展限制

大量的研究结果表明，胶原蛋白的性能可以满足用于作为表皮细胞、成纤维细胞、角膜细胞、软骨细胞及骨细胞的培养基质。

1、利用胶原蛋白制做组织工程支架材料，尚存在以下亟待解决的问题：

1）力学性能差，在含水条件下难以塑形，故不宜用于内部器官的重建；

2）体内及新生组织细胞产生的胶原蛋白酶极易将其降解；在体内降解吸收过快，不能与组织细胞生长繁殖的速度相匹配；

3）为提高胶原蛋白的力学性质和降低其在体内的降解吸收速度，使用戊二醛对胶原蛋白进行交联，形成网状交联大分子，但戊二醛用量较难控制，过量时引起胶原蛋白制品发黄，产生毒性，不利于组织细胞培养生长，量少时达不到改进胶原蛋白性能缺陷目的。

2、解决上述问题的基本途径主要有：

1）采用脱细胞技术制造天然的胞外基质（ECM）作为组织工程支架材料，其优点在于这种天然的ECM在体内可以组织填充物而长期存在，有较好的组织相容性和亲和性，还可以诱导和调节细胞的生长、繁殖和分化等。

2）采取物理、化学交联方法，克服胶原蛋白材料（主要是凝胶、膜等）所存在的降解吸收快、机械强度小的缺点。主要改性方法有①物理方法，如热交联、UV和γ射线交联等；采用物理方法交联的优点是不会引入有毒化学物质，但不易获得很好的交联强度，交联的均匀程度也不理想；②化学方法，通常采用戊二醛、甲醛进行交联。采用化学方法交联，可以获得均匀一致的交联，但交联过程可能会引入有毒的交联剂和产生不良的副反应。据报道，用酰基叠氮或聚环氧化物交联，既不会引入明显的毒性，又可获得理想的交联效果。此外，对胶原蛋白材料的低温等离子改性和用RGD肽（精氨酸甘氨酸天冬氨酸）接枝改性，可进一步改善胶原蛋白材料的生物学性能，提高其促进细胞粘附和增殖功能。

3）制备胶原蛋白基复合材料，为改善胶原蛋白材料的性能，利用胶原蛋白与其他合成材料、天然生物材料复合来制备胶原蛋白基复合材料已经成为一个重要的发展方向。

目前主要有①胶原蛋白透明质酸（HA）的复合物系统，它可以作为可注射骨替代材料；②胶原蛋白壳聚糖；③胶原蛋白poly［HEMA］与乙醇混合，用过硫酸铵和偏亚硫酸钠引发交联反应，制成烧伤用的贴膜，在膜中加入药物吲哚美辛。实验表明：胶原蛋白poly［HEMA］Ⅲ型胶原蛋白的复合物所具有的多孔海绵状结构是良好的药物释放系统，是制备烧伤用创面敷料的良好材料。

总之，解决上述问题后，胶原蛋白在医学领域中的应用前景将会更加广阔。

三、胶原蛋白产品技术发展现状

目前生产胶原蛋白产品的方法主要有酸法、碱法、盐法和酶法。盐法比较少见，酸法和碱法由于工艺简单、成本低廉而被普遍采用，但是这两种方法对胶原蛋白的分子结构都有很大的破坏。尤其是碱法生产的胶原蛋白，会对分子本身造成非常大的破坏，甚至产生致癌物质，固此法为工业产品的生产所使用。

其中酶法是目前最先进的一种生产方法，就是说利用胶原蛋白酶定向水解的方法生产胶原蛋白，这种方法是今年来国际上最领先的、最安全可靠的方法。以这种方法生产的胶原蛋白产品分子量稳定，分子结构保存完好，保持了很高的生物活性。德国（degussa）公司生产的胶原蛋白就是采用这种方法，该公司生产的胶原蛋白分子量为3000Da作用，符合人体吸收和保存的最佳结构。

由这种先进方法生产的胶原蛋白除了人体吸收和利用良好之外，还具有优良的物理性质，如：

1）速溶性——其细小的颗粒可以快速溶解在冷热水中，不会凝集成团；

2）无尘性——倾倒和分散Arthred的过程不会产生粉尘；

3）优良的流动性——不会产生凝聚，引起堵塞。

第二节 产品工艺特点或流程

1、除杂

油脂是提取胶原蛋白前应除去的主要杂质。如果胶原蛋白中混入脂质，则最终形成乳浊状的胶原蛋白溶液，从而使得脂质难以去除，影响胶原蛋白成品的纯度，脱脂方法主要有三种：

1）有机溶剂浸提法

用己烷作用于预处理后的皮，12h并不断的搅拌来脱脂，或采用丙酮除脂，所用的有机溶剂在脱脂后应除去，以免混入胶原蛋白成品中。

2）弱碱性溶液脱脂法

利用5%10%Na2CO3溶液脱脂或利用纯碱脱脂时辅以超声波来提高传质效率，仅作用3h脱脂率便可高达39.0%但超声波升温较快在处理过程中应注意温度控制，以免引起胶原蛋白变性。

3）脂肪酶法

假丝酵母CandidaLipolytica脂肪酶反应的最适pH值为7.5，最适温度为38℃。pH稳定范围为6.0-7.5，用去离子水洗涤三次后按酶与皮质量比为1：100的量加入酶，处理24h脱脂。在这个温度和pH值下对皮进行脱脂处理不会引起胶原蛋白变性，但酶的除去问题有待解决，混入成品会影响胶原蛋白质量从胶原蛋白产品纯度角度考虑。前两种方法中所加入的试剂在后续过程中易于除去，而第三种方法所用试剂的除去相对来说较为困难。对盐溶性蛋白及其它可溶性杂质可用水洗或10%的NaCl溶液浸泡以除去。

2、胶原蛋白溶出

酸法溶出皮胶原蛋白常用酸有：乙酸、盐酸、草酸、柠檬酸等。用0.1molL乙酸长时间浸泡皮块，皮中的未交联胶原蛋白可以溶解于醋酸中。通过冷冻干燥最后得到未变性胶原蛋白。用pH值为2.5的盐酸长时间作用于皮块来提取胶原蛋白，使用盐酸等强酸作用皮块，根据酸浓度水解温度。水解时间等条件的不同可以得到平均相对分子质量不等的胶原蛋白水解物，甚至彻底水解得到混合氨基酸。但是在等浓度酸彻底水解过程中色氨酸全部被破坏，丝氨酸和酪氨酸部分被破坏因此酸法溶出生物医用胶原蛋白要准确控制酸度、时间、温度等影响因素酶法可采用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等、常用的是胃蛋白酶。为提高提取率应在保持胶原蛋白不变性的前提下，在酶的最适温度和最适pH下进行提取操作。

控制酶降解到一定程度后必须考虑使酶失活，如用NaOH将上层清液的pH调至10并保持24h，来使胃蛋白酶失活或利用含NaCl的稀盐酸或酸性缓冲溶液作用使皮内残存的酶失活，也有向酶解液中加入20mmolL的EDTA使酶失活的研究。

3、纯化

酶解液可采用先盐析再透析的方法得到纯化的胶原蛋白，如将酶作用后的皮用纱布过滤，在滤液中加入NaCl固体进行盐析NaCl最终浓度小于4molL离心分离，得到的胶原蛋白再溶解于0.5molL的醋酸溶液中，然后在0.02molL的Na2HPO4pH8.6中透析。所得胶原蛋白冷冻干燥即可得到纯度96.3%的产品。或将酶解液调pH值到7，使胶原蛋白在等电点条件下沉淀，然后再在0.02molL的Na2HPO4pH8.6中透析得到胶原蛋白，盐析后可重复如下操作：离心、收集沉淀0.5molL乙酸复溶、离心、收集上清液盐析以提高得率。

第三节 国内外技术未来发展趋势分析

1、技术开发

目前许多产品的生产商围绕产品的安全性开发了不少产品，植物蛋白、天然产品、无添加剂等字样的产品得到消费者的青睐，长期以来，研究人员不断地探索，改进胶原蛋白的提取工艺，但至今仍存在着原料耗量高、时间长、产率低等问题。制约了胶原蛋白的深度开发与应用，因此，如何优化工艺条件提高皮胶原蛋白的提取纯度，并且在保证其纯度的前提下尽可能地提高产率，一直是研究及生产方面需要解决的难题。

2、产品多样化

随着市场需求的不断扩大，国内外胶原蛋白企业的逐渐增多，使产品趋于同质化，因此产品的不断丰富，迎合消费者的需求将是企业发展的一种动力。另外胶原蛋白在保健食品中的应用将是逐渐广泛，而胶原蛋白市场也会随着胶原蛋白研究的深入而逐步扩大应用范围，对产品的多样化开发也取得了更深层次的引导。

3、智能化

智能化的要求主要是针对胶原蛋白在医学方面的开发要求，随着生物分子研究的深入，胶原蛋白在医学材料领域起着十分重要的作用，而智能化的要求将会使产品在病人使用时更加便捷，减少病人痛苦。

4、胶原蛋白潜在的新应用

胶原蛋白的分散性使它可以代替传统的鱼胶作为啤酒和白酒的澄清剂；利用胶原蛋白的成膜性，可将其用作固化酶的膜材料和肉食品标签，后者已经在欧洲实际应用。

在胶原蛋白用于食品工业的研究方面，国外的研究比国内的研究更成熟。在国内，胶原蛋白食品的优越性还没有得到消费者的充分认识，随着人们生活水平的提高及对绿色食品的要求的提高，低脂高蛋白食品会越来越得到消费者的青睐。

胶原蛋白具有特殊的结构与功能，并具有广泛的用途，胶原蛋白的开发和利用，目前已经成为人们关注和研究的热点。随着生物和高分子科学的不断发展，人们会对此有更深的了解和认识。

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