细胞培养反应器技术工艺发展分析

第一节 细胞培养反应器基本生产技术、工艺或流程

动物细胞发酵罐是实现动物细胞大规模培养的枢纽与核心设备，为细胞生长提供相宜的环境，关系到细胞培养的质量和产量，因而在动物细胞大规模培养技术研究中据有举足轻重的地位，对于实现产业规模化高效出产具有重大意义。根据动物细胞的培养特性，具务低的剪切，较好的传递效果和液体力学性质是这类发酵罐设计或改进所必需遵循的原则。

两种重要的动物细胞培养发酵罐：

1、搅拌式发酵罐

搅拌式发酵罐靠搅拌浆提供相搅拌的动力，它有较大操纵范围、良好的混合性和浓度平均性，因此在生物反应中被广泛应用。动物细胞培养中的搅拌式发酵罐都是经由改进的，包括改进供氧方式、搅拌浆的形式及在发酵罐内加装辅件等。各种动物细胞培养搅拌式发酵罐的主要区别在于搅拌器的结构。这些搅拌器外形主要有棒形、气桨叶形、圆筒形，搅拌方式主要有表面搅拌、深层搅拌、气流搅拌；动力来源为磁力或是电念头驱动。

2、气升式发酵罐

气升式发酵罐也是实现动物细胞高密度培养的常用设备之一，尤其合用于培养切变敏感的细胞。气升式发酵罐与搅拌式发酵罐比拟，产生的湍动温顺而平均，剪切力相称小，器内没有机械运动部件，因而细胞操纵率比较低；直接喷射空气供氧，氧传递速率高；液体轮回量大，使细胞和营养成分能平均分布于培养基中。

第二节 细胞培养反应器新技术研发、应用情况

细胞培养反应器可简单地分为机械搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、中空纤维生物反应器以及抛弃式的一次性生物反应器等。目前，超过70％的动物细胞反应器是机械搅拌式生物反应器，而且细胞培养的最大规模已经放大到25000升。机械搅拌式生物反应器主要由罐体、电机和电子控制器等部分组成。实验室研究用的台式反应器（Bench bioreactor），罐体一般是玻璃的，疫苗或者抗体等工业化应用的罐体则由是不锈钢制造的。搅拌由顶端或底部的电机来驱动，能获得良好的混合和传质效果。罐体顶端或侧面的在线传感器，连接着控制器，可以连续测定罐体培养液的温度、pH值、溶氧（dissolve oxygen，DO）等参数，并通过计算机程序实现在线检测和控制。对于几升的玻璃罐，可以用高压锅灭菌；对于几十升、上百升及上千升以上的不锈钢罐，一般采用在线清洗（clean in place,CIP）和原位灭菌(sterilization in place, SIP)装置实现反应器的清洗和灭菌。搅拌式生物反应器的主要优点是，结构相对简单，既可用于悬浮培养，也适用于微载体培养，细胞培养工艺放大相对容易，产品质量稳定，非常适合于工厂化生产生物制品。但其机械搅拌会产生一定剪切力，可能对细胞造成的损伤，不过在实践应用中可通过改变搅拌桨叶形状、细胞培养基的改进等措施来解决。此外，动物细胞培养反应器的大型化、自动化和精巧化也成为大家关注的问题。

2008年起，北京天和瑞生物科技有限公司连续推出CLAVORUSTM120L、CLAVORUSTM 650L、CLAVORUSTM1200L动物细胞培养反应器，并在疫苗行业得到了成功应用，从而打破了我国动物细胞反应器完全依赖进口的局面，促进了我国疫苗等生物制药行业的技术升级。国产动物细胞反应器相比于进口反应器，无论从反应器质量控制、反应器配件提供、反应器供货速度等方面，还是在反应器工艺技术支持等方面，都有显著的优势，并从细胞培养工艺放大上解决了我国生物技术产业化种最薄弱的技术环节——动物细胞大规模培养技术的装备技术支撑问题,有利地推进了我国疫苗生产企业从大规模转瓶培养动物细胞疫苗工艺技术向生物反应器培养动物细胞疫苗工艺技术的转变。而这种疫苗工艺技术的转变，合乎世界生物制药发展趋势，也表明我国疫苗等生产技术正逐步与世界生物制药技术发展主流接轨。

第三节 细胞培养反应器国外技术发展现状

一些最新的生物反应器开发实例有：日本的三井石油公司开发的两槽培养系统可用于较一般的植物细胞培养场合；Jolicoeur等开发了工作容量为1lL的双螺旋带形搅拌浆反应器(dlouble halieal-ribbon impeller biloreabor)用于长春花细胞的高密度培养获得成功；Kim等将双重中空纤维反应器 (dual hollow fibre reactor)用于长春花细胞的固定化培养以维持高浓度和连续运转。

Inoue等人研究开发了一种新颖的中空纤维生物反应器，用于重组动物细胞的扩大培养。该装置由中空纤维反应器和灌流系统组成。液体通过泵在反应系统内循环，灌流系统补充或置换培养介质及移出代谢物。细胞在中空纤维膜的一侧生长，培养介质在膜的另一侧通过扩散向细胞传递营养。该反应器能为细胞提供一个温和的生长环境。用泵控制培养介质在反应器内循环。培养液在中空纤维腔内流动并通过中空纤维膜向另一侧供应细胞生长所需的养分。通过培养30 d后，单克隆抗体hMAb浓度达250μg／ml。重组的细胞BHk-21密度达2.1×106个／CM3。

Fang等人用旋转壁生物反应器(Rotating_wallBio—reactor)培养细胞。旋转壁生物反应器的培养室可以饶纵轴或横轴旋转。细胞在旋转反应器内一方面受到自身重力的沉降，同时受到离心力的作用，两者达到平衡。从而使细胞在反应器内受到较小的剪切力，其大小还不到在普通反应器里培养时所受到的1/10。另外，该反应器还有利于营养物质的循环及废物的排放。实验表明，旋转壁生物反应器非常适合动物细胞生长。

第四节 细胞培养反应器技术开发热点、难点分析

培养系统中由于细胞生长和次生产物合成不相藕合，批式培养系统逐步发展成为补料批式和多步批式培养系统。要实现培养过程的在线检测，包括对温度(T)、溶氧量(DO)、pH值、泡沫及细胞浓度(光密度法)、氧气和二氧化碳浓度比 (O2／CO2)等的检测，另外要实现培养过程无故障及杂菌污染。反应器的设计与改进应综合考虑氧传输、混合性能和剪切力强度，包括改变气体交换器构型、搅拌器构型、挡板的位置与数目甚至反应器的构型等因素。利用二相(溶剂相和水相)培养的反应器系统可以使产物及时与反应物分离，避免了产物的抑制效应，能提高培养效率。通过自由振荡或采用DNA合成的选择性抑制剂处理细胞，如不同时期细胞继代培养和延迟生长素的添加，诱导细胞同步分裂，可以使营养物质的利用和产物的合成达到最大化，从而提高反应器的生产性能。Kitkby和Faraday采用反应器的进料振荡而使细胞生命的循环趋于同步，最终反应器内细胞处于同一生长阶段，在设定的时间下从反应器内获得较高的目的产物浓度，生产效率提高50％，这是植物细胞大规模培养生产次生代谢产物的一个崭新的思路。

植物细胞培养这一领域的重大发展要求生物学和工程As含量，因此TF主要由地上部As的含量所决定。根系对As的吸收能力SAU主要由根部As的含量所决定，二者呈极显著正相关关系，相关系数达0.903，但与根部生物量相关性并不显著，这主要是由于根部质量较小以及各品种问差异不显著所造成的。

第五节 细胞培养反应器未来技术发展趋势

1、探索多种细胞培养方式。生物反应器毕竟是动植物细胞培养的基本装置，同样的设备在采用不同的操作方式，可以达到不同的效果。

2、与下游分离技术结合，使细胞培养与产物提取在生物反应器内同步进行。

3、现代基因工程技术发展迅速，转基因药物及食品不断出现。所以，开发适合基因工程细胞培养的生物反应器也大有发展前景。

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